【Promega】激酶 TE 检测工具列表
激酶相关载体
预构建激酶融合蛋白及调控蛋白表达载体
Promega 提供的预构建即用型激酶检测用载体共341 个，调控表达蛋白14 个。通过不同组合一共可以检测346 个激酶。
为研究者提供便利，减少自行构建载体所花费的时间，配合 Promega 提供的检测系统即组成激酶 TE 检测完整解决方案。
完整检测系统
NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay
检测一个特定的激酶 Target Engagement, kinase-NanoLuc® fusion vector 需要搭配或者不搭配 regulatory expression vector, 并使用推荐的NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay来完成。根据Tracer不同，共有7种独特的检测系统，每种都有3个规格。
其中 No control DNA 的版本的试剂盒中不包含对照激酶融合蛋白载体。另外检测系统中的有些组分也单独销售。
示踪剂
NanoBRET™ tracer
NanoBRET™ tracer 是一种生物可利用的小分子配体或靶蛋白抑制剂，与荧光染料共价结合。Promega 研发了多种NanoBRET™ tracer，作为 NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay system 的一部分 ，具体来说， NanoBRET™ TEKinase assays 是通过与激酶 NanoLuc® 萤光素酶融合蛋白可逆地结合的可透细胞膜的 NanoBRET™ tracer 的竞争性置换来分析受试化合物的细胞中的亲和力。激酶 NanoLuc® 融合蛋白作为能量供体，而荧光 NanoBRET™ TE Tracer 作为 BRET 分析的能量受体。NanoBRET™ TE Tracer 可以单独购买，也可以作为 NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay 的一部分购买。
每套 NanoBRET™ TE Kinase Assay 提供了 NanoBRET™ 检测所需的试剂，包括 NanoBRET™ Tracer, NanoBRET™ NanoGlo® Substrate, Extracellular NanoLuc® Inhibitor 和 Tracer Dilution Buffer 。NanoBRET™ TE Tracers 为使用者研究新的激酶或测试替代 Tracer 提供了更大的灵活性。特异性激酶 NanoLuc® 融合载体需单独购买。推荐的 NanoBRET™ tracer 和所选激酶的 NanoLuc® 融合蛋白的 Tracer 浓度可在下面的链接中找到。
www.promega.com/resources/guides/kinase-target-engagement-assay-selection-table
底物&抑制剂
Intracellular TE Nano-Glo® Substrate/Inhibitor 和 Intracellular TE Nano-Glo® Vivazine™/Inhibitor 是专为 NanoBRET™ Target Engagement (TE) Assays 而设计，用于检测活细胞中的化合物与靶蛋白的选择性结合。试剂中 NanoLuc® substrates 的量足够在特定时间段内产生 BRET 检测所需的明亮的发光信号。Extracellular NanoLuc® inhibitor 是一种不能透过细胞膜的分子，可以用于抑制细胞外环境的任何 NanoLuc® 信号。做终点法检测或 2 小时以内的检测推荐用 Intracellular TE Nano-Glo® Substrate 。
检测时间超过 2 小时以上的推荐使用半衰期更长的的底物如 Nano-Glo® Vivazine™ Substrate。该底物是 NanoBRET™ NanoGlo® Substrate 的衍生物，可以产生长达 72 小时的光信号，同时自发光更低，更适用于滞留时间检测。
根据检测时间的不同， NanoBRET™ Nano-Glo® Substrate 和 Nano-Glo® Vivazine™ Substrate 均可为 NanoBRET™ 的活细胞完整细胞检测提供良好的光信号，特别是与 Extracellular NanoLuc® Inhibitor 搭配共同使用的时候。
检测仪器
GloMax® Discover 多功能检测仪
高效，易用的多功能检测仪
用于化学发光，荧光，吸收光，BRET 和 FRET
• 使用简单
选择预置的 Promega 程序或编辑您自己需要的程序。数据可输出至网络，云，LIMS 或其他服务器。容易实现化学发光，荧光，UV- 可见吸收光，BRET 和 FRET 检测。
• 可实现自动化
可与您的自动化工作流程整合实现高通量检测，或者整合进您的 LIMS 数据管理系统。
• 超高灵敏度
动态范围宽，灵敏度高，孔间交叉干扰小，使得您的数据更加可信。
• 手动干扰最小化
自动转换滤片，轻松实现多重检测。
• 节省人力
预置的程序可节省优化程序的时间。
• 直观的软件界面
触摸屏可实现编辑程序，整合自动化平台，输出数据。
其他 NanoBRET TE 产品
●检测 BET BRD 相关药物 Target Engagement 的检测系统
NanoBRET™ Target Engagement BET BRD Assays 系列产品也是基于 NanoBRET™ TE 的技术原理，专为 BET BRD 靶点的药物 : 靶蛋白结合检测而设计。该系列产品提供包含实验组分的完整检测系统，同时其组分也可单独购买。
应用举例：评估化合物与关键药物靶蛋白 BRDs 的结合。
右图：表达 NanoLuc®-BRD4 全长融合蛋白的瞬时转染 HEK293 细胞中的 Tracer 竞争。将表达 NanoLuc®-BRD4 全长融合蛋白的 HEK293细胞重悬于培养基中，接种于 96 孔板中，并与不同浓度的 Tracer 混合。
以未经修饰的渐增浓度的 iBET-151 作为竞争性抑制剂处理细胞 2 小时，然后加入 3X Complete Substrate plus Inhibitor Solution。以带有 NanoBRET™ 618 滤片 (donor 450nm/8nm BP & acceptor 600nmLP) 的 GloMax® Discover System 检 测 BRET。BRET 比值原始数据转换为 milliBRET 单位 (mBU) ，并绘制出与 iBET-151 抑制剂浓度的关系图，以确定化合物的明显细胞内亲和力。推荐浓度为 0.5μM NanoBRET BET BRD Tracer 生成的 IC50 值 ™ 以粗体显示。
注意，较低的 Tracer 浓度会带来更准确的细胞内化合物亲和力的评估，但分析窗口较窄。在估计细胞内化合物亲和力时，使用较低浓度的 Tracer 可能更准确。
应用文献：
Waring, M.J., Chen, H., Rabow, A.A., Walker, G., Potent and selective bivalent inhibitors of BET bromodomains. Nat Chem.Biol. 12(12), 1097–1104，2016
文献应用产品：
• NanoBRET™ Nano-Glo® Detection System
• NanoBRET™ TE Intracellular BET BRD Assay
• NanoBRET™ TE Intracellular BET BRD Complete Kit
• NanoBRET™ TE Intracellular BET BRD Detection Reagents
• GloMax® Discover System
●检测 HDAC 相关药物 Target Engagement 的检测系统
NanoBRET™ Target Engagement HDAC Assays 系列产品也是基于 NanoBRET TE 的技术原理，专为 HDAC 靶点的药物 : 靶蛋白结合检测而设计。该系列产品提供包含实验组分的完整检测系统，同时其组分也可单独购买。
应用举例 - 滞留时间分析：瞬时转染表达有 HDAC1-NanoLuc®全长融合蛋白的 HeLa 细胞的滞留时间分析
右图：表达 HDAC1-NanoLuc® 全长融合蛋白的 HeLa 细胞以培养基重悬，以 10μM SAHA 或 10μM mocetinostat 结合并孵育 2 小时。
去掉化合物后，细胞铺在 96 孔板中，Complete 20X NanoBRET™ Tracer 和 2X NanoBRET™ Nano-Glo® Substrate plus Extracellular NanoLuc® Inhibitor Solution 加入到每个孔中。使用带有 NanoBRET™ 618 滤 片 (donor 450nm/8nm BP 和 acceptor 600nm LP) GloMax® Discover System 反复检测 BRET。
应用文献：
Robers, M.B, Dart, M.L., Woodroofe, C.C, Zimprich, C.A.,et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nat. Commun. 6, 10091 . 2015
文献应用产品：
• NanoBRET™ Positive Control
• NanoBRET™ Nano-Glo® Detection System
• NanoBRET™ PPI MCS Starter System
• NanoBRET™ PPI Flexi® Starter System
• NanoBRET™ TE Intracellular HDAC Assay
• NanoBRET™ TE Intracellular BET BRD Assay
点在看，传递你的品味
