【Serumwerk】反刍动物和马血液分离单核细胞（Hyaline leukocyte）
反刍动物和马血液分离单核细胞不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™（使用前轻轻摇动）
B. 稀释剂：0.85%（w/v）氯化钠，30 mM Tricine-NaOH，pH 7.4（仅限方案B）
C. Tricine缓冲盐水（TBS）：0.85%氯化钠，20 mM Tricine-NaOH，pH 7.4
试验方法
方案A
1．用肝素、柠檬酸盐或EDTA作为抗凝剂采血，用等体积的溶液C稀释。
2．用4.6体积的溶液C将1.4体积的溶液a稀释成1.078 g/ml溶液。
3．在合适的离心管中层2体积稀释血液超过1体积1.078 g/ml的溶液。
4．以800 g离心30 min。
5．允许转子在没有刹车的情况下减速，然后从接口收集PBMCs。
6．用两体积的溶液C稀释收集的材料，并将细胞在500 g下颗粒化15分钟。
方案B
1. 使用肝素、柠檬酸盐或EDTA作为抗凝剂采血。
2. 配制37% (w/v)碘克沙醇工作液:将3.7 vol的OptiPrep™与2.3 vol的溶液B混合。
3.将10 ml全血与1.25 ml OptiPrep™或2.5 ml工作液反复倒置混合，然后将0.5 ml溶液C铺在上面。
4. 在20℃下以1000 gav离心30分钟。
5. 允许转子在没有刹车的情况下减速，然后从半月板向下收集PBMCs到距离细胞颗粒约0.5 cm的地方。
6. 用两体积的缓冲盐水稀释收集的材料，并在300-400 g下将细胞颗粒化15分钟。
方法注释
1．试验方案中使用Tricine-NaOH缓冲液，但可替换任何适宜的缓冲液。
2．最佳抗凝剂的选择最好由经验决定。
3．就人血而言，从培养基中获取PBMCs通常在250-300 g 10分钟内进行。这不足以将所有牛PBMCs打成颗粒——300-400 g 15分钟可恢复所有细胞。
4．与纯化人PBMCs一样，该细胞将被血浆中的血小板污染。可通过优先以低RCF (250-300 g持续10分钟)将细胞制成颗粒来实现从人PBMCs中部分去除血小板。然后将细胞重新悬浮在生理盐水中，重复洗涤过程。这是否是牛PBMCs的一种令人满意的方法还没有经过严格的测试。
5．用等体积的溶液C稀释可完全去除人PBMCs中的血小板;分层使用碘克沙醇，ρ = 1.063 g/ml (5体积OptiPrep™+ 22体积Solution C)，350 g离心15 min, 20℃。血小板在界面下方形成一条宽带;将整个液体吸入并将PBMC颗粒重新悬浮于适宜培养基中。是否这是一个满意的方法牛PBMCs还没有测试。
6．如果不希望在方案B的步骤3中将未缓冲的OptiPrep™添加到血液中，则使用含有37% (w/v)碘克沙醇(ρ = 1.199 g/ml)的缓冲工作溶液。
7．样品上的少量生理盐水对分离不是必需的，但它有助于从血浆上获取PBMCs。它还可以防止细胞在半月板处的管壁上聚集和粘附。
8．Olsen和Storset对小牛血的离心时间为35分钟，而不是30分钟。
9．用10 ml牛血浮选PBMCs的总回收率分别为1.085 × 107和1.265 × 107。
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