【Genovis】PNGase F，N-聚糖水解酶

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PNGase F(Peptide N-glycosidase F)是一种糖苷酶，可水解多肽天门冬酰胺和最内层GlcNAc（所有哺乳动物天门冬酰胺连接复杂的、杂合的或高甘露寡糖）之间的酰胺键。该酶被广泛用于质谱分析前的样品制备——以减少蛋白质的异质性，并使释放聚糖分析成为可能——以及研究N-聚糖的功能作用。

◆◆糖蛋白上的N-链聚糖

◆◆水解N-聚糖和Asn之间的糖苷键

◆◆大于15分钟反应时间

◆◆无需其他辅助材料

去糖基化工作流程

PNGaseF水解N-聚糖和天冬酰胺之间的糖苷键。在反应过程中，天门冬酰胺残基除去聚糖后脱酰胺成天门冬氨酸。释放出来的聚糖是完整的，可以用于进一步的分析。

在自然和变性反应条件下，PNGaseF处于激活状态。

产品形式

在自然条件下使用PNGaseF去除N-聚糖

在自然条件下，用PNGaseF去除Fc N-聚糖，可以表征游离N-聚糖以及去糖基化抗体的功能和结构。曲妥珠单抗被用来证明在自然条件下PNGaseF和固定PNGase F能够有效去除N-聚糖。这种质量转移证明了Fc N-聚糖被成功去除，而不影响固定化PNGaseF处理样品的分析。

在自然条件下去除N-聚糖。左图为完整曲妥珠单抗Fc/2片段的TIC色谱图，右图为Fc/2片段的解卷积质谱图。完整的曲妥珠单抗（图上），固定PNGase F（图下）或PNGase F（图中）在37°C条件下处理1小时的曲妥珠单抗。抗体样品用FabRICATOR消化后进行分析。

使用PNGaseF进行释放聚糖分析

治疗蛋白的N-糖基化是一个关键的质量属性。它影响生物制药的安全性和有效性，因此需要在开发和生产过程中对其进行表征和监测。在这里，曲妥珠单抗，Fc融合蛋白依那西普和糖蛋白RNase B使用释放聚糖方法进行分析。曲妥珠单抗和依那西普在自然条件下与PNGase F进行去糖基化，而RNase B需要变性和还原才能完全去糖基化。释放的多糖用RapiFluor-MS™(Waters 公司)标记，并用HILIC UPLCFLD-MS进行分析。

释放糖蛋白的聚糖分析。使用HILIC-FLD-MS分析曲妥珠单抗(上)、依那西普(中)和RNase B(下)释放的RapiFluor-MS™ 标记的N-甘氨酸：Waters™BioAccord™系统，配备了Waters™ACQUITY Premier Glycan BEH酰胺色谱柱(130Å, 2.1×150mm). 。荧光色谱图如图所示，糖链结构通过葡萄糖单位（GU）库检索和质谱验证进行解析。

使用PNGaseF去除N-聚糖

利用PNGase F和固定化PNGase F进行糖蛋白去糖基化的关键特征和SDS-PAGE分析。该表详细说明了检测的糖蛋白的重要特征，用于去糖基化的反应条件和SDS-PAGE分析前的样品准备。凝胶上的质量转移表明，经过PNGase F或固定化PNGase F处理后，从各种糖蛋白底物中成功去除N-聚糖。

固定化PNGase F在变性条件下快速去除N-聚糖

PNGaseF不易接近一些糖基化位点，去糖基化反应缓慢或受到空间位阻的抑制。为了证明在变性条件下反应速度的提高，融合蛋白阿巴西普被固定化PNGase F处理，使用自然条件（Native）或变性条件（Denaturing)工作流程。自然条件下可以在没有任何添加剂或升高温度的情况下去除N-聚糖，但需要整夜(18小时)的孵育才能完全去糖基化。使用变性条件去除N-聚糖在30分钟内完成。从质谱中可以看出，所有的N-聚糖都被去除，而O-聚糖则保持不变。完整的蛋白分析比较复杂，但经固定化PNGase F处理后，样品的复杂性大大降低。

未消化处理的(上图，Undigested)，用固定化PNGase F在变性(中图，Denaturing)或自然条件(下图，Native)下处理的阿巴乙酰的反卷积质谱。用固定的PNGase F在自然反应条件下孵育18小时，或用变性条件孵育30分钟。去糖基化蛋白样品被还原，用反相LC-MS分析：Waters™ BioAccord™ 系统，配备一个Waters™ BioResolve™ RP mAb柱(2.1x 50mm)。质量转移表明N-聚糖被完全清除，只留下O-聚糖糖型。